當前頁面:首頁 > 新聞中心新聞中心
科學家發表CRISPR-Cas9新應用
導讀:最近,加州大學圣地亞哥醫學院細胞和分子醫學系教授Steven F. Dowdy博士帶領的研究小組,在國際著名學術期刊《Nucl Acids Res》發表一項研究,開發出一種高效的CRISPR/Cas9和rAAV靶向基因重組方法,通過將表型突變加選擇性siRNA位點同時引入一個基因的一個等位基因中,來研究哺乳動物的基因功能。
加州大學圣地亞哥醫學院細胞和分子醫學系教授Steven F. Dowdy博士長期以來從事細胞周期和蛋白質轉導領域的研究工作。最近,他帶領的課題組先后在多家國際著名學術期刊發表重要研究成果。生物通 www.ebiotrade.com
在2014年7月份,該課題組在《eLife》發表的一篇論文中表示,他們發現在調控細胞周期進程中起至關重要作用的一種蛋白并非以往認為的、導致一個重要的腫瘤抑制因子失活,而是激活了它。這一研究發現是該研究小組差不多20年研究工作的結果,它完全顛覆了原來所認為的:在癌癥中一種叫做p16-cyclin D的最常見遺傳信號通路突變驅動了所有癌細胞中細胞周期進程的一個基本方面。相關閱讀:20年研究顛覆癌癥教條。接著在11月份,該小組在Nature旗下子刊《Nature Biotechnology》發表了他們所開發的一種新技術:采用化學方法來偽裝RNAi藥物,使得它們能夠進入到細胞中。一旦進入,細胞機器會將這些偽裝的藥物前體siRNNs轉變為活性RNAi藥物。
新年伊始,該課題組又在國際著名學術期刊《Nucl Acids Res》發表題為“Efficient CRISPR-rAAV engineering of endogenous genes to study protein function by allele-specific RNAi”的論文。在這項研究中,研究人員開發出一種高效的CRISPR/Cas9和rAAV靶向基因重組方法,通過將表型突變加選擇性siRNA位點同時引入一個基因的一個等位基因中,來研究哺乳動物的基因功能,可允許在同一細胞中進行野生型和突變型蛋白的表達。
研究哺乳動物基因功能的經典方法是,用遺傳學手段敲除基因或用RNAi刪除mRNA,從而去除感興趣的蛋白,來誘導一種表型。為了確認所靶定的基因是否為誘變基因,我們需要修復相同基因一個變異體的異位表達所引起的功能表型缺失。遺憾的是,組成型基因敲除可激活一種顯著損害表型和基因功能的代償機制。
相反,急性RNAi介導的基因缺失可以揭示更多的功能,并帶來一個更為詳細的分子機制。然而,修復基因缺失或損耗,同樣充滿了潛在危險。通常使用蛋白質表達系統——包括誘導型啟動子下面穩定的整合基因組結構,往往會顯著過度表達修復的蛋白質,從而改變蛋白質-蛋白質間相互作用的化學計量,并可能導致潛在的假陽性“修復”結果。而缺乏適當的基因調控,可以通過使用小基因或細菌人工染色體得以解決,這些方法對細胞來說是一種人造情況。
為了彌補這一差距,該研究小組開發出一種高效的CRISPR/Cas9和rAAV靶向基因重組方法,通過將表型突變加上選擇性siRNA位點同時引入一個基因的一個等位基因中,來研究哺乳動物的基因功能,可允許在同一細胞中野生型和突變型蛋白的表達。
通過轉染相應的表達質粒和篩選siRNA序列,研究人員可容易地識別沉默的點突變,以產生siSN序列。rAAV和等位基因特異性siRNA相結合,可讓我們選擇性地研究相同遺傳學背景中內源條件下表達和調控的單倍不足(siSN)和突變體(siWT)。更重要的是,最近一項單細胞RNA-seq研究確定,76%到88%的人類常染色體基因是雙等位基因,只有12%到24%的是單等位基因。這表明,該研究小組開發的CRISPR–Cas9和 rAAV方法,應該能夠適用于人類基因組中絕大部分的基因。
總的來說,這種CRISPR加rAAV方法,對于研究內源基因功能具有廣泛的適用性,大大克服了經典基因修復方法的相關問題。
加州大學圣地亞哥醫學院細胞和分子醫學系教授Steven F. Dowdy博士長期以來從事細胞周期和蛋白質轉導領域的研究工作。最近,他帶領的課題組先后在多家國際著名學術期刊發表重要研究成果。生物通 www.ebiotrade.com
在2014年7月份,該課題組在《eLife》發表的一篇論文中表示,他們發現在調控細胞周期進程中起至關重要作用的一種蛋白并非以往認為的、導致一個重要的腫瘤抑制因子失活,而是激活了它。這一研究發現是該研究小組差不多20年研究工作的結果,它完全顛覆了原來所認為的:在癌癥中一種叫做p16-cyclin D的最常見遺傳信號通路突變驅動了所有癌細胞中細胞周期進程的一個基本方面。相關閱讀:20年研究顛覆癌癥教條。接著在11月份,該小組在Nature旗下子刊《Nature Biotechnology》發表了他們所開發的一種新技術:采用化學方法來偽裝RNAi藥物,使得它們能夠進入到細胞中。一旦進入,細胞機器會將這些偽裝的藥物前體siRNNs轉變為活性RNAi藥物。
新年伊始,該課題組又在國際著名學術期刊《Nucl Acids Res》發表題為“Efficient CRISPR-rAAV engineering of endogenous genes to study protein function by allele-specific RNAi”的論文。在這項研究中,研究人員開發出一種高效的CRISPR/Cas9和rAAV靶向基因重組方法,通過將表型突變加選擇性siRNA位點同時引入一個基因的一個等位基因中,來研究哺乳動物的基因功能,可允許在同一細胞中進行野生型和突變型蛋白的表達。
研究哺乳動物基因功能的經典方法是,用遺傳學手段敲除基因或用RNAi刪除mRNA,從而去除感興趣的蛋白,來誘導一種表型。為了確認所靶定的基因是否為誘變基因,我們需要修復相同基因一個變異體的異位表達所引起的功能表型缺失。遺憾的是,組成型基因敲除可激活一種顯著損害表型和基因功能的代償機制。
相反,急性RNAi介導的基因缺失可以揭示更多的功能,并帶來一個更為詳細的分子機制。然而,修復基因缺失或損耗,同樣充滿了潛在危險。通常使用蛋白質表達系統——包括誘導型啟動子下面穩定的整合基因組結構,往往會顯著過度表達修復的蛋白質,從而改變蛋白質-蛋白質間相互作用的化學計量,并可能導致潛在的假陽性“修復”結果。而缺乏適當的基因調控,可以通過使用小基因或細菌人工染色體得以解決,這些方法對細胞來說是一種人造情況。
為了彌補這一差距,該研究小組開發出一種高效的CRISPR/Cas9和rAAV靶向基因重組方法,通過將表型突變加上選擇性siRNA位點同時引入一個基因的一個等位基因中,來研究哺乳動物的基因功能,可允許在同一細胞中野生型和突變型蛋白的表達。
通過轉染相應的表達質粒和篩選siRNA序列,研究人員可容易地識別沉默的點突變,以產生siSN序列。rAAV和等位基因特異性siRNA相結合,可讓我們選擇性地研究相同遺傳學背景中內源條件下表達和調控的單倍不足(siSN)和突變體(siWT)。更重要的是,最近一項單細胞RNA-seq研究確定,76%到88%的人類常染色體基因是雙等位基因,只有12%到24%的是單等位基因。這表明,該研究小組開發的CRISPR–Cas9和 rAAV方法,應該能夠適用于人類基因組中絕大部分的基因。
總的來說,這種CRISPR加rAAV方法,對于研究內源基因功能具有廣泛的適用性,大大克服了經典基因修復方法的相關問題。
(來源:生物通)
上一篇:張鋒:用新型高效Cas9實現基因組編輯
下一篇:CAS鋁鎂質保溫隔熱氈