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利用CRISPR/Cas9來(lái)攻克乙肝
在一項(xiàng)新研究中，麻省理工學(xué)院的研究人員利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，對(duì)受到感染的哺乳動(dòng)物肝細(xì)胞進(jìn)行基因組編輯，從中刪除了乙肝病毒（HBV）DNA。根據(jù)發(fā)表在《Scientific Reports》雜志上的研究結(jié)果，該研究小組靶向切割了HBV病毒共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）的一些特異位點(diǎn)。
根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）報(bào)道，全球有20多億人曾受到過(guò)乙型肝炎病毒感染，大約3.5億至4億人罹患慢性HBV感染，在亞洲和非洲發(fā)病率尤其高。他們面臨著形成肝硬化或甚至肝癌的高風(fēng)險(xiǎn)。盡管現(xiàn)有的抗病毒藥物可以控制乙型肝炎病毒，但卻不能完全清除它。因此，一旦停止治療患者肝臟中的HBV會(huì)重新活化。這是因?yàn)閏ccDNA “匿藏”在細(xì)胞核中。
HBV的基因組（rcDNA）進(jìn)入到細(xì)胞核后，rcDNA在病毒蛋白和宿主細(xì)胞因子的幫助下修復(fù)成cccDNA。前基因組RNA（pgRNA）出核后，在胞質(zhì)中形成εpgRNA，并與病毒的聚合酶P蛋白共價(jià)結(jié)合，誘發(fā)核衣殼化。與多數(shù)其他的病毒DNA的機(jī)制不同，HBV cccDNA通過(guò)pgRNA的反轉(zhuǎn)錄進(jìn)行復(fù)制，而cccDNA主要以微小染色體的形式存在于肝細(xì)胞內(nèi)，且其半衰期很長(zhǎng)（33～100天），細(xì)胞核內(nèi)的最長(zhǎng)壽命可達(dá)14年。
只要還存在于肝細(xì)胞中，cccDNA乙肝病毒的復(fù)制就不會(huì)停止，并與病毒蛋白裝配成新的完整HBV，以芽生的方式再感染健康的肝細(xì)胞，而這是導(dǎo)致乙肝復(fù)發(fā)的根本原因。因此，盡管每個(gè)肝細(xì)胞內(nèi)只有約5～50個(gè)cccDNA拷貝，但是只要這些cccDNA池穩(wěn)定，就可以使得病毒的持續(xù)感染延續(xù)，因而清除肝細(xì)胞內(nèi)的cccDNA是乙肝徹底治愈所必需的。
CRISPR （clustered regularly interspersed short palindromic repeats）/Cas是源于細(xì)菌及古細(xì)菌中的一種后天免疫系統(tǒng)，它可利用靶位點(diǎn)特異性的RNA指導(dǎo)Cas蛋白對(duì)靶位點(diǎn)序列進(jìn)行修飾。其中的一個(gè)關(guān)鍵因子就是Cas酶，能用于切斷靶標(biāo)DNA，比如目的基因中的DNA片段，另外一個(gè)就是稱(chēng)為導(dǎo)向RNA（gRNA）的RNA分子，這種分子能通過(guò)互補(bǔ)結(jié)合靶標(biāo)。隨著以CRISPR/Cas9為基礎(chǔ)的基因編輯技術(shù)靶標(biāo)特異性不斷得到提高，其在血液病、腫瘤、傳染病和其他遺傳疾病等一系列與人類(lèi)健康和疾病相關(guān)的基因治療的應(yīng)用領(lǐng)域展現(xiàn)出極大的應(yīng)用前景。
論文的主要作者之一Vyas Ramanan說(shuō)：“我們?yōu)槲磥?lái)利用CRISPR/Cas9來(lái)靶向慢性HBV感染提供了強(qiáng)有力的理論依據(jù)。”
Ramanan和同事們?cè)O(shè)計(jì)了24條單鏈向?qū)NAs （sgRNAs）來(lái)靶向從在線病毒序列信息資源庫(kù)中鑒別出的一些HBV基因組位點(diǎn)。經(jīng)過(guò)初篩測(cè)試后，研究小組將三個(gè)最有效的sgRNAs和Cas9蛋白插入到慢病毒載體中，然后將它們轉(zhuǎn)導(dǎo)到了整合HBV的人類(lèi)肝細(xì)胞內(nèi)。
Ramanan說(shuō)：“對(duì)包含整合基因組病毒DNA的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系展開(kāi)實(shí)驗(yàn)，我們看到HBV總DNA和cccDNA逐漸減少，在36天時(shí)cccDNA下降了92%。”研究小組還觀察到病毒基因表達(dá)和復(fù)制均顯著減少。“進(jìn)一步地在從頭感染模型中我們開(kāi)展研究，在第9天我們看到這些病毒參數(shù)同樣大幅度降低。”
現(xiàn)在，Ramanan計(jì)劃在人類(lèi)肝嵌合小鼠模型中測(cè)試這一方法，以評(píng)估和優(yōu)化傳遞方法和給藥方法，及更好地了解需要除去多少的cccDNA才能到達(dá)人類(lèi)功能性的治愈。
“盡管還有很多的工作要做，但我認(rèn)為這是一個(gè)有趣的開(kāi)始，”Ramanan說(shuō)。
根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）報(bào)道，全球有20多億人曾受到過(guò)乙型肝炎病毒感染，大約3.5億至4億人罹患慢性HBV感染，在亞洲和非洲發(fā)病率尤其高。他們面臨著形成肝硬化或甚至肝癌的高風(fēng)險(xiǎn)。盡管現(xiàn)有的抗病毒藥物可以控制乙型肝炎病毒，但卻不能完全清除它。因此，一旦停止治療患者肝臟中的HBV會(huì)重新活化。這是因?yàn)閏ccDNA “匿藏”在細(xì)胞核中。
HBV的基因組（rcDNA）進(jìn)入到細(xì)胞核后，rcDNA在病毒蛋白和宿主細(xì)胞因子的幫助下修復(fù)成cccDNA。前基因組RNA（pgRNA）出核后，在胞質(zhì)中形成εpgRNA，并與病毒的聚合酶P蛋白共價(jià)結(jié)合，誘發(fā)核衣殼化。與多數(shù)其他的病毒DNA的機(jī)制不同，HBV cccDNA通過(guò)pgRNA的反轉(zhuǎn)錄進(jìn)行復(fù)制，而cccDNA主要以微小染色體的形式存在于肝細(xì)胞內(nèi)，且其半衰期很長(zhǎng)（33～100天），細(xì)胞核內(nèi)的最長(zhǎng)壽命可達(dá)14年。
只要還存在于肝細(xì)胞中，cccDNA乙肝病毒的復(fù)制就不會(huì)停止，并與病毒蛋白裝配成新的完整HBV，以芽生的方式再感染健康的肝細(xì)胞，而這是導(dǎo)致乙肝復(fù)發(fā)的根本原因。因此，盡管每個(gè)肝細(xì)胞內(nèi)只有約5～50個(gè)cccDNA拷貝，但是只要這些cccDNA池穩(wěn)定，就可以使得病毒的持續(xù)感染延續(xù)，因而清除肝細(xì)胞內(nèi)的cccDNA是乙肝徹底治愈所必需的。
CRISPR （clustered regularly interspersed short palindromic repeats）/Cas是源于細(xì)菌及古細(xì)菌中的一種后天免疫系統(tǒng)，它可利用靶位點(diǎn)特異性的RNA指導(dǎo)Cas蛋白對(duì)靶位點(diǎn)序列進(jìn)行修飾。其中的一個(gè)關(guān)鍵因子就是Cas酶，能用于切斷靶標(biāo)DNA，比如目的基因中的DNA片段，另外一個(gè)就是稱(chēng)為導(dǎo)向RNA（gRNA）的RNA分子，這種分子能通過(guò)互補(bǔ)結(jié)合靶標(biāo)。隨著以CRISPR/Cas9為基礎(chǔ)的基因編輯技術(shù)靶標(biāo)特異性不斷得到提高，其在血液病、腫瘤、傳染病和其他遺傳疾病等一系列與人類(lèi)健康和疾病相關(guān)的基因治療的應(yīng)用領(lǐng)域展現(xiàn)出極大的應(yīng)用前景。
論文的主要作者之一Vyas Ramanan說(shuō)：“我們?yōu)槲磥?lái)利用CRISPR/Cas9來(lái)靶向慢性HBV感染提供了強(qiáng)有力的理論依據(jù)。”
Ramanan和同事們?cè)O(shè)計(jì)了24條單鏈向?qū)NAs （sgRNAs）來(lái)靶向從在線病毒序列信息資源庫(kù)中鑒別出的一些HBV基因組位點(diǎn)。經(jīng)過(guò)初篩測(cè)試后，研究小組將三個(gè)最有效的sgRNAs和Cas9蛋白插入到慢病毒載體中，然后將它們轉(zhuǎn)導(dǎo)到了整合HBV的人類(lèi)肝細(xì)胞內(nèi)。
Ramanan說(shuō)：“對(duì)包含整合基因組病毒DNA的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系展開(kāi)實(shí)驗(yàn)，我們看到HBV總DNA和cccDNA逐漸減少，在36天時(shí)cccDNA下降了92%。”研究小組還觀察到病毒基因表達(dá)和復(fù)制均顯著減少。“進(jìn)一步地在從頭感染模型中我們開(kāi)展研究，在第9天我們看到這些病毒參數(shù)同樣大幅度降低。”
現(xiàn)在，Ramanan計(jì)劃在人類(lèi)肝嵌合小鼠模型中測(cè)試這一方法，以評(píng)估和優(yōu)化傳遞方法和給藥方法，及更好地了解需要除去多少的cccDNA才能到達(dá)人類(lèi)功能性的治愈。
“盡管還有很多的工作要做，但我認(rèn)為這是一個(gè)有趣的開(kāi)始，”Ramanan說(shuō)。
(來(lái)源：生物通)
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