【中國化工儀器網 國際新聞】來自清華大學、中科院微生物研究所的研究人員報告稱，他們開發出了一種新技術，通過Cas9輔助靶向染色體片段（CATCH），可一步靶向克隆出大基因簇（延伸閱讀：華人學者技術突破：將CRISPR應用于分子克隆）。這一重要的研究成果發布在9月1日的《自然通訊》（Nature Communications）雜志上。

        清華大學的朱聽（Ting Zhu）研究員、特拉維夫大學的Yuval Ebenstein，以及中科院微生物研究所的婁春波（Chunbo Lou）研究員是這篇論文的共同通訊作者。

        在工程改造生物體以生成高附加價值的生物分子，諸如藥物制劑和生物燃料的相關研究工作中，克隆大基因簇的長基因組片段是其中一個重要的步驟。傳統基于PCR的克隆方法往往受到序列長度和DNA模板GC含量的限制：標準PCR反應常規可生成長度為10kb的片段，而獲得更長的PCR產物則需要繁瑣地去優化反應條件，即便在理想的條件下通常也限制在35 kb。或者，可以通過組裝多個短片段，如重疊PCR產物或化學合成的DNA寡核苷酸來生成感興趣的長基因組序列，但這樣的方法往往費時且昂貴，尤其是想要獲得長度大約50 kb的序列時（這通常需要3-5個階段，每個階段包含多個組裝事件）。

        另一個獲得長基因組序列的途徑就是采用限制性酶來消化基因組DNA。然而，作為一種非靶向性方法，從大量的限制性消化產物中挑出特異的目的序列非常具有挑戰且麻煩。某些技術如轉化介導的重組克隆方法（TAR）和單鏈逐次退火，已被用于在限制性酶消化后來特異性克隆長細菌基因簇。但這些技術的應用仍然受到限制，因為它們依賴于在靶基因組區域兩邊獲得獨特的限制位點，并且在靶序列中存在選擇標記物。為了推動生物技術和合成生物學進步，開發出一種通用方法來克隆常規方法難于獲得的幾乎任意的長基因組序列至關重要。

        向導RNAs可以引導CRISPR-Cas9核酸酶來切割靶DNA的特異序列。就釀膿鏈球菌（spCas9）來說，向導RNA系統由CRISPR RNA （crRNA）和反式激活crRNA（tracrRNA）構成——二者可融合形成單鏈向導序列（single guide RNA， sgRNA）。靶向序列包含與crRNA互補的前間隔序列（protospacer）和.前間隔序列鄰近基序（PAMs）。相比于傳統的限制性酶有著限制為4–8 bp的固定識別位點，使用長的（~20 bp）、可編程的前間隔序列來作為識別位點，可為spCas9核酸酶系統提供高度的靶向特異性和通用性。這已推動廣泛開發出了用于基因組編輯、序列特異性控制基因表達、體內成像的基于Cas9的工具。相比之下，尚未充分探索Cas9系統的體外潛在應用；研究人員主要將焦點放在了測試Cas9的切割效率和序列識別特異性上。

        在這篇文章中研究人員證實spCas9除了是一種通用的基因組編輯工具，體外應用spCas9可以前所未有的效率和簡易性克隆大基因簇。他們描述了一種技術，其能夠一步靶向克隆幾乎任意的、長達100kb的長細菌基因組序列。在體外借助于RNA引導的Cas9核酸酶在兩個指定位點從細菌染色體中切下目標基因組片段，然后通過Gibson組裝將其連接到克隆載體中。這一技術可成為目標克隆大基因簇一種有效的分子工具。

      

(來源：生物通)